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聚合酶鏈式反應(PCR)如何做呢?

添加日期:2018年03月19日 關鍵字: 點擊次數:308 次

導讀:聚合酶鏈式反應(PCR)如何做呢?

  實驗方法原理:PCR技術的基本原理類似于DNA的天然復制過程,其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。

  PCR由變性--退火--延伸三個基本反應步驟構成:

 ?、倌0錎NA的變性:模板DNA經加熱至94℃左右一定時間后,使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離,使之成為單鏈,以便它與引物結合,為下輪反應做準備;

 ?、谀0錎NA與引物的退火(復性):模板DNA經加熱變性成單鏈后,溫度降至55℃左右,引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合;

 ?、垡锏难由欤篋NA模板--引物結合物在Taq酶的作用下,以dNTP為反應原料,靶序列為模板,按堿基配對與半保留復制原理,合成一條新的與模板DNA 鏈互補的半保留復制鏈。

  重復循環變性--退火--延伸三過程,就可獲得更多的“半保留復制鏈”,而且這種新鏈又可成為下次循環的模板。每完成一個循環需2~4分鐘, 2~3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。

  實驗材料:模板DNA

  試劑、試劑盒:dNTP,Taq DNA聚合酶,蒸餾水,PCR緩沖液,引物,氯化鎂

  儀器、耗材:PCR儀,移液槍,PCR板,薄壁管,離心管,離心管盒

  實驗步驟:

  一、標準的PCR反應體系

  10×擴增緩沖液:10 ul;4種dNTP混合物:各200 umol/L;引物:各10~100 pmol;模板DNA:0.1~2 ug;Taq DNA聚合酶:2.5 u;Mg2+:1.5 mmol/L;加雙或三蒸水至:100 ul

  二、PCR引物設計

  PCR反應中有兩條引物,即5′端引物和3′引物。設計引物時以一條DNA單鏈為基準(常以信息鏈為基準),5′端引物與位于待擴增片段5′端上的一小段DNA序列相同;3′端引物與位于待擴增片段3′端的一小段DNA序列互補。

  1.   引物設計的基本原則

 ?。?)  引物長度:15-30 bp,常用為20 bp左右。

 ?。?) 引物堿基:G+C含量以40-60%為宜,G+C太少擴增效果不佳,G+C 過多易出現非特異條帶。ATGC隨機分布,避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。

 ?。?) 引物內部不應出現互補序列。

 ?。?)兩個引物之間不應存在互補序列,尤其是避免3 ′端的互補重疊。

 ?。?) 引物與非特異擴增區的序列的同源性不要超過70%,引物3′末端連續8個堿基在待擴增區以外不能有完全互補序列,否則易導致非特異性擴增。

 ?。?)引物3‘端的堿基,特別是最末及倒數第二個堿基,應嚴格要求配對,最佳選擇是G和C。

 ?。?) 引物的5 ′端可以修飾。如附加限制酶位點,引入突變位點,用生物素、熒光物質、地高辛標記,加入其它短序列,包括起始密碼子、終止密碼子等。

  2.   引物設計軟件

  Primer Premier5.0 (自動搜索)*、Oligo6 (引物評價)、Vector NTI Suit、DNAsis、Omiga、DNAstar、Primer3 (在線服務)。

  三、模板的制備

 ?。?)PCR的模板可以是DNA,也可以是RNA。

 ?。?)模板的取材主要依據PCR的擴增對象,可以是病原體標本如病毒、細菌、真菌等。也可以是病理生理標本如細胞、血液、羊水細胞等。法醫學標本有血斑、精斑、毛發等。

 ?。?)標本處理的基本要求是除去雜質,并部分純化標本中的核酸。多數樣品需要經過SDS和蛋白酶K處理。難以破碎的細菌,可用溶菌酶加EDTA處理。所得到的粗制DNA,經酚、氯仿抽提純化,再用乙醇沉淀后用作PCR反應模板。

  四、PCR反應條件的控制

  1.  PCR反應的緩沖液提供合適的酸堿度與某些離子 。

  2.  鎂離子濃度 總量應比dNTPs的濃度高,常用1.5 mmol/L?! ?/span>

  3.  底物濃度dNTP以等摩爾濃度配制,20~200 umol/L?!?/span>

  4.  TaqDNA聚合酶2.5U(100 ul)?! ?/span>

  5.  引物 濃度一般為0.1 ~0.5 umol/L?!?/span>

  6.  反應溫度

 ?。?)變性溫度和時間95℃,30 s。

 ?。?)退火溫度和時間 低于引物Tm值5 ℃左右,一般在45~55℃。

 ?。?)延伸溫度和時間72℃,1 min/kb(10 kb內)。

 ?。?)Tm值=4(G+C) +2(A+T)

  7.  循環次數 :一般為25 ~30次。循環數決定PCR擴增的產量。模板初始濃度低,可增加循環數以便達到有效的 擴增量。但循環數并不是可以無限增加的。一般循環數為30個左右,循環數超過30個以后,DNA聚合酶活性逐漸達到飽和,產物的量不再隨循環數的增加而增加,出現了所謂的“平臺期”。

  五、PCR的循環參數

  1.  預變性(Initial denaturation)

  模板DNA完全變性與PCR酶的完全激活對PCR能否成功至關重要,建議加熱時間參考試劑說明書,一般未修飾的Taq酶激活時間為兩分鐘。

  2.  循環中的變性步驟

  循環中一般95℃,30秒足以使各種靶DNA序列完全變性,可能的情況下可 縮短該步驟時間,變性時間過長損害酶活性,過短靶序列變性不徹底,易造成擴增失敗。

  3.  引物退火(Primer annealing)

  退火溫度需要從多方面去決定,一般根據引物的Tm值為參考,根據擴增的長度適當下調作為退火溫度。然后在此次實驗基礎上做出預估。

  退火溫度對PCR的特異性有較大影響。

  4.  引物延伸

  引物延伸一般在72℃進行(Taq酶最適溫度)。但在擴增長度較短且退火溫度較高時,本步驟可省略延伸時間隨擴增片段長短而定,一般推薦在1000 bp以上,含Pfu及其衍生物的衍生設定為1 min/kbp。

  5.  循環數

  大多數PCR含25-40循環,過多易產生非特異擴增。

  6.  最后延伸

  在最后一個循環后,反應在72℃維持5-15分鐘.使引物延伸完全,并使單鏈產物退火成雙鏈。

  六、PCR步驟

  1.  DNA變性

 ?。?0℃-96℃):雙鏈DNA模板在熱作用下, 氫鍵斷裂,形成單鏈DNA。

  2.  退火

 ?。?5℃-65℃):系統溫度降低,引物與DNA模板結合,形成局部雙鏈。

  3.  延伸

 ?。?0℃-75℃):在Taq酶(在72℃左右,活性最佳)的作用下,以dNTP為原料,從引物的5′端→3′端延伸,合成與模板互補的DNA鏈。

  七、PCR檢測

  PCR反應擴增出了高的拷貝數,下一步檢測就成了關鍵。熒光素(溴化乙錠,EB)染色凝膠電泳是最常用的檢測手段。電泳法檢測特異性是不太高的,因此引物兩聚體等非特異性的雜交體很容易引起誤判。但因為其簡捷易行,成為了主流檢測方法。近年來以熒光探針為代表的檢測方法,有逐漸取代電泳法的趨勢。

  注意事項:

  1.  由于PCR反應靈敏度很高,因此要特別主意防止DNA污染的發生。樣品間的相互污染可能產生假陽性結果,特別是將PCR技術應用到臨床病原菌感染確定中。

  2.  如果是公用的、沒有密碼保護的PCR儀,經常檢查PCR儀上的程序正確與否。

  3.  不使用過量試劑“less is usually better (more specific)”。

  4.  試劑購回后應分裝成小份使用,這樣一旦有污染發生,可以立即丟棄污染的試劑,不會造成大的損失;試劑分裝也有助于減少反復凍融次數(例如dNTPs對反復凍融敏感)。

  5.  加完所有試劑后用槍頭吹打幾次或稍微渦旋或輕彈管壁以保證充分混勻。

  6.  使用陰性對照檢查污染的發生。

  7.  使用陽性對照(能良好擴增的樣本)。

  8.  電泳時使用DNA分子量標準品(指示是否PCR失敗或條帶跑出凝膠或拍照系統失?。?。

  9.  當擴增很長的、GC含量高的模板時或容易產生二級結構的模板時適量使用添加劑(glycerol, formamide, NMP使變性和退火溫度降低幾度;glycerol也可起到穩定聚合酶活性的作用;DMSO 減少二級結構的發生,并通過減弱非特異性引物結合的穩定性,提高反應的特異性)。

  10.  不使用帶有自動除霜功能的冰箱存儲酶(避免反復凍融),每次取酶時都使用新的槍頭酶,酶使用后應立即放回冰箱。酶要在加完緩沖液后再加,直接將酶加入水中可能導致酶變性失活。

  11.   PCR產物的電泳檢測時間,一般為48 h以內,有些于當日電泳檢測,大于48h后帶型不規則甚致消失。

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